단백질 표면의 작은 홈에 잘 들어맞아 보이는 분자가, 단백질과 주변 물이 움직여도 그 자리에 머물까. Keap1 연구에서 확인하려던 문제다. 처음의 짧은 계산에서는 morroniside를 유망하게 봤지만, 사람의 Keap1을 대상으로 조건을 맞추고 반복 계산한 뒤에는 catalpol과 geniposide를 먼저 시험할 후보로 남겼다.
Keap1은 세포가 산화 스트레스에 대응하는 과정을 조절하는 단백질이다. 표면의 한쪽 홈에는 다른 단백질인 Nrf2의 일부가 붙는다. 나는 작은 분자 다섯 개를 이 홈에 놓고 움직임을 비교하면서, 실제 결합 실험에서 무엇부터 확인할지 좁혀 갔다. 여기서 다룬 것은 Nrf2의 짧은 아미노산 서열인 ‘ETGE’가 붙는 자리로, 세포나 사람에게 효과가 있는지까지 시험한 연구는 아니다.
이 결과를 논문으로 정리했고, 2026년 8월 18일 In Silico Pharmacology에 실렸다. 계산에서 추린 두 후보가 실제로도 Keap1에 붙는지는 실험으로 확인해야 한다. 논문 보기 · PubMed
처음 유망했던 물질부터 다시 살폈다
처음에는 분자가 홈에 들어갈 만한 자세를 찾고 점수를 매기는 도킹 계산을 사용했다. 하지만 잘 맞는 자세를 하나 찾는 것과, 움직이는 동안에도 그 자리에 남는 것은 다른 문제였다. 그래서 원자들의 움직임을 작은 시간 간격으로 계산해 이어 보는 분자동역학(MD)으로 그 뒤를 살폈다.
초기 계산에서 우선 후보로 봤던 물질은 morroniside였다. 다만 그때는 사람의 Keap1이 아닌 구조를 썼고 분자의 전하를 표현하는 방식도 통일돼 있지 않아, 짧은 계산 한 번의 결과로 우선순위를 정하기에는 비교 조건부터 맞춰야 했다.
다시 비교할 때는 처음 정한 다섯 물질을 모두 남겼다. Catalpol, geniposide, loganin, morroniside는 이리도이드 배당체이고, coptisine은 양전하를 띠는 알칼로이드다. 이 물질들과 Nrf2 관련 작용을 다룬 문헌이 있어도, 그것만으로 Keap1의 이 홈에 직접 붙는다고 볼 수는 없었다. 같은 사람 Keap1 구조와 전하 계산법을 적용한 뒤 물질마다 200 ns 계산을 세 번씩 진행했다.
200 ns는 컴퓨터를 켜 둔 시간이 아니라, 모형 안에서 따라간 분자 운동의 시간이다. 1 ns는 10억 분의 1초로, 다섯 물질의 세 반복을 합치면 15개의 움직임 기록, 총 3 μs가 된다. 이 움직임 기록을 궤적이라고 부른다.
다시 계산하면서 단백질 구조, 전하 모형, 계산 길이와 반복 횟수를 함께 바꿨다. 후보가 달라진 이유를 ‘세 번 반복했기 때문’ 하나로 설명할 수는 없지만, 조건을 통일해 비교해도 처음의 우선순위가 유지되는지는 확인할 수 있었다.
홈에 닿아 있다는 것만으로는 충분하지 않았다
분자가 홈 주변에 계속 닿아 있어도 처음과 전혀 다른 방향으로 돌아앉을 수 있다. 그래서 접촉 여부와 함께 처음 자세에서 얼마나 달라졌는지를 봤다. 단백질 전체가 움직인 것을 분자만의 움직임으로 잘못 세지 않도록, 단백질의 위치와 방향을 먼저 맞춘 뒤 비교했다.
그 차이를 숫자로 나타낸 것이 아래 표의 RMSD다. 이 비교에서는 값이 작을수록 분자가 처음 자세에서 덜 벗어났다는 뜻이다. 옆의 접촉 비율은 홈의 기준 아미노산과 가까이 있었던 시간의 비율로, 1에 가까울수록 저장된 장면 대부분에서 접촉이 유지됐다는 의미다. 둘 중 하나만 높거나 낮다고 곧바로 좋은 후보가 되는 것은 아니다.
| 물질 | 처음 자세에서 달라진 정도: RMSD, Å | 홈의 기준 아미노산과 접촉한 비율 |
|---|---|---|
| Catalpol | 1.39 ± 0.20 | 0.999 ± 0.002 |
| Geniposide | 1.10 ± 0.54 | 0.960 ± 0.032 |
| Loganin | 5.25 ± 1.42 | 0.901 ± 0.123 |
| Morroniside | 18.70 ± 9.19 | 0.496 ± 0.443 |
| Coptisine | 30.62 ± 4.41 | 0.133 ± 0.118 |
RMSD는 수소를 제외한 원자들로 계산했다. 각 반복에서 중앙값을 구한 뒤 그 세 값의 평균과 표본표준편차를 적었으며, 접촉 비율도 반복별 비율 세 개를 같은 방식으로 요약했다. 접촉은 기준 아미노산 여섯 개 중 하나 이상이 분자에서 5 Å 안에 있는 경우다. Å는 원자 수준의 거리를 나타내는 단위로 1 Å = 0.1 nm다. 이 숫자는 모형 안에서의 움직임과 접촉을 나타내며, 결합력이나 약효를 측정한 값은 아니다.
Catalpol과 geniposide는 세 번 모두 홈 부근에서 비교적 작은 자세 변화를 보였다. 두 물질을 먼저 시험할 후보로 남긴 이유다. 반면 loganin은 접촉 비율이 높아도 반복마다 자세가 달라지고 홈 가장자리 쪽으로 재배치됐다. 접촉 비율만 봤다면 이 차이를 놓쳤을 것이다.
처음 유망하게 봤던 morroniside는 세 번의 결과가 특히 달랐다. RMSD 중앙값은 각각 22.34, 8.25, 25.50 Å였는데, 두 번째 반복에서는 접촉 비율이 1.000이면서도 처음 자세를 유지하지는 않았다. 나머지 두 번에서는 더 큰 이동이 나타났다. 세 번 모두 같은 방식으로 이탈했다고 묶지 않고, 홈 근처에 머무는 방식과 이동 정도를 나눠 해석했다. Coptisine은 세 번 모두 큰 이동을 보였다.
도킹 점수와 비교해도 이 구분이 드러났다. Coptisine은 처음 자세에 매긴 점수로는 다섯 물질 중 세 번째였지만, 이후 움직임에서는 홈으로부터 크게 벗어났다. 다섯 사례로 도킹의 일반적인 성능을 평가할 수는 없어도, 이번에는 그 점수만으로 후보를 고르지 않기로 한 판단을 뒷받침했다.
두 후보 중 하나를 억지로 1등으로 고르지는 않았다
움직임을 기준으로 catalpol과 geniposide를 남긴 뒤에는, 에너지를 계산했을 때도 두 후보를 다르게 봐야 하는지 살폈다. 저장된 궤적에서 구조를 골라 단백질과 분자가 함께 있는 상태의 에너지를 계산하고, 둘을 따로 계산한 에너지를 빼서 비교했다. 이처럼 이미 얻은 구조를 꺼내 평가하는 방식을 엔드포인트 계산이라고 한다.
반복마다 10 ns 간격으로 20개 구조를 골라, 두 물질에서 총 120개를 평가했다. Catalpol은 −30.46 ± 1.18, geniposide는 −31.79 ± 3.95 kcal/mol이었다. 반복마다 평균 에너지를 구한 뒤 세 평균값을 다시 요약했으며, ± 뒤의 표본표준편차는 그 세 값이 얼마나 흩어져 있는지 나타낸다. Geniposide의 평균값이 조금 더 낮지만, 세 반복의 평균값이 걸친 범위는 서로 겹쳤다. Catalpol은 −31.45~−29.16, geniposide는 −34.39~−27.24였다. 이 정도 차이로 둘의 우열을 정하지 않고, 두 후보를 남기는 보조 근거로 사용했다.
이 계산은 실제 결합 세기를 측정한 실험이 아니다. 분자가 자유롭게 움직일 수 있는 정도와 관련된 엔트로피 항을 포함하지 않았고, 같은 궤적에서 뽑은 구조들도 서로 독립적인 실험 표본은 아니다. 다른 세 물질은 홈에 머문다는 근거가 약해 이 단계에 넣지 않았다. 따라서 다섯 물질을 에너지 점수로 다시 줄 세운 결과로 읽어서도 안 된다.
계산으로 좁힌 두 후보, 실험으로 확인할 부분
처음 우선순위를 그대로 유지하지 않고, 조건을 맞춰 비교한 결과에 따라 먼저 시험할 물질을 바꿨다. 이번 연구에서 내가 내린 판단은 여기까지다. 이 모형에서 비교적 일관되게 홈 부근에 남았던 catalpol과 geniposide가 실제 Keap1에도 직접 붙는지 확인하는 것이 다음 단계다.
실험에서는 SPR·ITC·MST 같은 방법으로 결합 자체를 측정하고, 별도로 Nrf2의 ETGE 펩타이드와 같은 자리를 두고 경쟁하는지 살펴야 한다. 세포의 Nrf2 관련 반응이 달라졌다는 결과만으로는 직접 결합을 확인할 수 없으므로, 표적에 붙었는지와 간접적인 스트레스 반응이 생겼는지도 나눠 확인해야 한다. 이 실험들은 이번 연구에서 수행하지 않았다.
계산에서 남긴 것은 정해진 모형과 관찰 시간 안에서 먼저 시험해 볼 두 후보다. 실제 결합 속도나 체내 노출, 신경보호·임상 효과까지 알아낸 것은 아니다. 아래에는 이 판단에 사용한 조건과 세부 점검을 남겼다. 계산을 직접 비교하거나 다시 따라가려면, 같은 ‘Keap1 시뮬레이션’이라도 어떤 구조와 기준을 썼는지까지 맞춰 봐야 하기 때문이다.
계산 조건과 세부 점검
단백질 전체가 아니라, 비교할 홈이 있는 부분을 사용했다
사람 Keap1의 입체 구조는 PDB 2FLU에서 가져왔다. 여기에 함께 있던 Nrf2 펩타이드를 제거하고, 실제 좌표가 있는 325–609번 잔기의 Kelch 도메인을 사용했다. 도메인은 단백질의 한 부분으로, 이번 모형에는 ETGE 결합 홈이 포함되지만 Keap1 전체가 들어 있지는 않다. 구조에 좌표가 없던 302–324번 구간을 임의로 채우지도 않았다.
도킹에서는 분자가 이 홈 주변의 어느 위치와 방향에 들어갈 수 있는지 탐색했다. AutoDock Vina 1.2.5에서 탐색 상자의 중심을 (7.536, 13.905, 2.234) Å, 크기를 24 × 24 × 30.218 Å로 두고, 탐색 강도를 정하는 exhaustiveness는 32, 최대 자세 수는 20으로 설정했다. 난수 과정의 시작값인 seed는 1이다.
이 단계에서는 단백질을 고정해 두고, 도킹에서 물질별로 가장 유리하게 평가된 자세 하나를 골라 MD를 시작했다. 이후 세 번의 MD를 돌렸다고 해서 서로 다른 도킹 자세 세 개에서 출발한 것은 아니다. 도킹 점수는 geniposide −9.22, catalpol −8.70, coptisine −8.26, loganin −7.71, morroniside −7.24 kcal/mol이었다.
분자마다 다른 규칙이 적용되지 않도록 조건을 맞췄다
MD는 원자 사이에 작용하는 힘을 정해 놓고 움직임을 계산한다. 어떤 힘의 모형을 쓰고 물과 전하를 어떻게 표현하느냐도 결과를 읽을 때 함께 봐야 할 조건이다. 다섯 물질에 아래의 공통 설정을 적용하되, coptisine이 양전하를 띤다는 차이는 그대로 반영했다.
| 계산에서 정한 것 | 사용한 조건 |
|---|---|
| 단백질과 분자의 힘을 표현하는 모형 | 단백질 ff14SB, 분자 GAFF2 |
| 분자 내부의 전하 분포 | AM1-BCC 부분전하 |
| 분자 전체 전하 | 네 이리도이드 배당체 0, coptisine +1 |
| 물과 소금 | TIP3P 물, 약 0.15 M NaCl |
| 계산 프로그램과 환경 | OpenMM 8.5.2, 310 K, 1 bar |
| 한 번에 계산하는 시간 간격 | 4 fs. 이를 위해 수소 질량을 4 amu로 재분배하고 수소가 포함된 공유결합의 길이를 제한 |
| 멀리 떨어진 원자 사이의 정전기 처리 | PME |
| 세 반복의 난수 시작값 | seed 1, 2, 3 |
| 움직임을 저장한 간격 | 0.1 ns마다 한 장면, 200 ns 궤적당 2,000개 프레임 |
여기서 프레임은 저장된 한 시점의 원자 배치다. 한 반복에서 2,000개를 저장했어도 독립적인 실험을 2,000번 한 것은 아니며, 앞뒤 장면은 같은 움직임에 속한다. 그래서 위의 후보 비교 표도 프레임 수를 반복 횟수처럼 쓰지 않고, 세 번의 계산을 각각 요약한 뒤 비교했다.
자세가 바뀐 것인지, 홈에서 멀어진 것인지 나눠 봤다
처음 자세에서 벗어나는 데에는 분자가 돌아앉는 경우도 있고, 홈 밖으로 이동하는 경우도 있다. RMSD만으로 둘을 구분하기 어려워 홈 중심에 대한 분자의 위치 변화도 따로 계산했다. 정확히는 분자와 홈 중심 사이의 벡터가 처음보다 얼마나 달라졌는지로, 홈과의 절대 거리나 이동 경로의 총길이는 아니다.
또 분자가 홈과 맞닿아 물에 노출되지 않는 표면이 얼마나 생기는지도 봤다. 이를 매몰 용매접근표면적, 매몰 SASA라고 한다. 넓게 맞닿아 있는지 살피는 보조 지표이지, 이것만으로 결합 세기를 정하는 값은 아니다.
| 물질 | 홈을 기준으로 한 위치 변화, Å | 맞닿아 물에 노출되지 않게 된 표면적, nm² |
|---|---|---|
| Catalpol | 0.68 ± 0.02 | 5.10 ± 0.03 |
| Geniposide | 0.83 ± 0.48 | 5.41 ± 0.15 |
| Loganin | 3.58 ± 0.86 | 3.52 ± 0.30 |
| Morroniside | 17.41 ± 10.41 | 2.62 ± 1.29 |
| Coptisine | 30.04 ± 4.77 | 1.62 ± 0.13 |
위치 변화도 궤적별 중앙값 세 개의 평균과 표본표준편차다. 표면적은 nm²로 표시했다. 접촉 분석에서는 수소 이외 원자 사이의 4 Å 이내 접촉과 수소결합도 함께 확인했으며, 앞서 5 Å 접촉 비율을 계산할 때 기준으로 삼은 아미노산 여섯 개는 Ser363, Arg380, Asn382, Arg415, Arg483, Ser508이다.
분자뿐 아니라 단백질 쪽에서 어느 부분이 흔들리고 어떤 부분이 함께 움직이는지도 살폈다. 잔기별 흔들림은 RMSF, 잔기 두 곳의 움직임이 함께 변하는 정도는 DCCM으로 분석했다. 여러 움직임 중 큰 변화 양상을 요약하는 PCA와, 자세 변화(RMSD)·구조가 퍼진 정도를 나타내는 회전반경의 분포도 확인했다. 다만 분자가 없는 Keap1이나 Nrf2 펩타이드가 붙은 Keap1을 같은 조건으로 비교하지는 않았다. 이 분석만으로 분자의 결합이 단백질 다른 부위의 기능까지 바꿨다고, 즉 알로스테리가 나타났다고 결론 내리지는 않았다.
갑자기 멀어진 좌표를 실제 이탈로 단정하지 않았다
시뮬레이션에서는 물과 분자가 든 상자가 주변에 반복되는 것으로 계산한다. 이를 주기적 경계라고 하는데, 상자 경계를 넘은 분자가 이웃 상자 쪽에 표시되면 좌표상으로 갑자기 멀어진 것처럼 보일 수 있다. 물을 제거해 보관한 궤적을 분석할 때는 먼저 단백질을 정렬하고, 이런 경우 분자를 격자 단위로 옮겨 홈 가까이에 놓았다.
그 처리로도 설명되지 않는 갑작스러운 좌표 변화가 남았다. 기하학 분석에서는 해당 장면을 삭제하거나 사이값을 만들어 채우지 않고, 전체 프레임 결과와 함께 중앙값·상위 95백분위수를 살폈다. 좌표 변화가 컸다는 이유만으로 실제 분자가 같은 방식으로 이동했다고 해석하지 않기 위해서다.
에너지를 계산할 구조를 고를 때는 별도의 좌표 점검을 적용했다. Geniposide의 첫 번째 반복에서 원래 고른 100.1 ns 구조가 이상 조건에 해당해, 가장 가까운 미사용 정상 구조인 99.6 ns로 바꿨다. 기준은 주기경계를 처리한 뒤 분자의 수소 이외 원자 RMSD가 40 Å를 넘고, 0.1 ns 사이에 20 Å를 넘는 가역적 좌표 점프가 나타나며, 홈 접촉이 0인 경우였다. 에너지 값이 유리한 구조를 골라 바꾼 것은 아니다. 이 한 표본을 바꿨다고 해서 원래 궤적의 기하학 분석에서도 그 장면을 지운 것은 아니다.
에너지 값도 사용한 모형 안에서 비교했다
앞서 두 후보를 비교한 엔드포인트 계산에서는 물 분자를 하나씩 계산하는 대신, 주변 물을 연속적인 매질로 근사하는 GBn2를 사용했다. 여기에 표면적에 따른 ACE 항을 더했다. 이 선택 때문에 계산값을 다른 방법의 값과 비교할 때도 같은 에너지 모형인지 확인해야 한다.
원래 좌표를 움직이거나 에너지가 낮아지도록 재조정하는 최소화를 거치지 않고, 원자와 결합 정보를 담은 같은 토폴로지에서 복합체·단백질·분자 부분을 나눠 평가했다. GBn2/ACE와 mbondi3 반경을 사용했고, 전기적 상호작용에 쓰는 내부·외부 유전율은 1/78.5, 염 농도는 0.15 M이었다. ACE 표면항은 Amber의 LCPO와 같지 않아 두 방식의 수치를 그대로 섞지 않았다.
다시 확인할 수 있도록 남긴 자료
논문과 함께 반복별 후처리 결과, 상관·분포 분석, 점검 기록과 분석 스크립트를 공개했다. 원시 좌표 궤적과 토폴로지 전체가 공개 ZIP 안에 들어 있는 것은 아니며, 이 자료들은 출판사의 안내대로 합리적인 요청을 받아 제공하는 범위다. 논문·보충자료 안내
R2.2 개정에서는 보관해 둔 궤적의 후처리와 설명을 보강했다. 앞서 비교 조건을 바꿔 MD를 진행한 단계와 달리, 이 개정에서는 MD를 추가로 연장하지 않았다.
2026년 9월 5일에는 보관된 후처리 CSV로 표의 집계값을 다시 점검했다. 15개 궤적의 30,000개 프레임 행에서 RMSD·홈 기준 위치 변화·접촉 비율을 다시 요약해, 표의 평균·표준편차 30개가 반올림 범위에서 일치하는지 확인했다. 새로운 시뮬레이션이나 외부 연구자의 재현을 한 것은 아니지만, 이미 얻은 움직임 기록이 표의 수치로 옮겨지는 과정은 다시 확인할 수 있었다.
논문 서지 정보: Byungwoong Yoo, 단독 저자 · Independent Researcher · In Silico Pharmacology 14, 211 (2026) · DOI: 10.1007/s40203-026-00724-2.